Laporan Pewarnaan Bakteri ( Mikrobiologi & Parasitologi Farmasi )

BAB I

PENDAHULUAN

A.    Latar belakang

      Bakteri adalah salah satu mikroorganisma yang menjadi masalah besar dalam dunia kesehatan. Setiap bakteri menyebabkan infeksi yang berbeda jika kontak dengan host. Misalnya diare yang disebabkan oleh bakteri E.coli, pneumonia yang disebabkan oleh streptococcus pnumoniae, tb paru disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis dan lain-lain. Oleh sebab itu maka identifikasi setiap bakteri penyebab infeksi adalah hal yang penting untuk diketahui.

      Meskipun isolasi dan identifikasi mikrobiologi penyebab kontaminasi atau infeksi dilakukan dengan menggunakan media pertumbuhan mikroorganisma dan uji biokimia, namun salah satu petunjuk awal untuk identifikasi adalah bentuk morfologi bakteri.

      Pewarnaan bakteri adalah prosedur yang paling mudah untuk membedakan jenis bakteri satu dan lainnya berdasarkan bentuk dan struktur dinding selnya. Pewarnaan bakteri akan dapat melihat bentuk morfologi (batang, coccus, koma, dan spiral) dan pengelompokan bakteri (gram positif dan gram negatif).

Praktikum kali ini akan mempraktekkan cara pewarnaan bakteri untuk melihat bentuk morfologi bakteri dengan teknik pewarnaan sederhana dan pewarnaan negatif. Sedangkan pengelompokkan jenis bakteri berdasarkan struktur dinding sel bakteri ditentukan dengan pewarnaan gram atau pewarnaan BTA.

B.     Tujuan praktikum

1.      Menerapkan teknik pewarnaan sederhana, pengecatan gram dan pengecatan negatif untuk pengamatan bentuk morfologi bakteri.

2.      Menentukan penggolongan bakteri dengan metode pewarnaan gram.

C.    Prinsip percobaan

      Memahami dan membedakan teknik pewarnaan sederhana dengan memberikan metilen-biru dan pewarnaan gram dengan memberikan kristal violet, lugoli, asam alkohol, safranin, dan minyak imersi dengan menggunakan mikroskop untuk melihat morfologi dari masing-masing bakteri.

D.    Manfaat praktikum

      Memahami cara pengamatan bentuk morfologi bakteri dengan menggunakan metode pewarnaan sederhana, pewarnan negatif, pewaraan gram.

 

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A.    Dasar teori

      Proses pewarnaan dimulai dengan membuat sediaan bakteri pada kaca object. Kemudian dilakukan fiksasi dengan pemanasan. Fiksasi berguna untuk:

1.      Melekatkan specimen pada gelas object

2.      Membunuh bakteri tanpa merusak morfologinya

3.      Memudahkan bakteri untuk diwarnai, dan

4.      Menyimpan slide yang belum sempat diwarnai.

Ada beberapa macam pewarnaan bakteri yang dimatikan yaitu:

1.      Pewarnaan sederhana

      Pewarnaan sederhana disebut pula pewarnaan langsung atau pewarnaan progresif. Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam bahan pewarna. Sebagai bahan pewarna dapat berupa metilen-biru, safranin gentian ungu, fukhsin dan lain-lain. Tujuan pewarnaan sederhana ini untuk melihat bentuk morfologi bakteri .

2.      Pewarnaan diferensial

      Pewarnaan diferensial karena dengan melakukan pewarnaan tersebut dapat dibuat diferensiasi dari bakteri yang diwarnai. Yang termasuk pewarnaan diferensiasi adalah pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam.

a.       Pewarnaan gram

            Pewarnaan gram ditemukan oleh Hans Christian Gram pada tahun 1884. Berdasarkan pewarnaan gram, bakteri dibagi menjadi dua golongan, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan bahan warna dasar setelah dilakukan proses pelunturan dengan alkohol 96%. Pewarna yang digunakan adalah kristal violet dan safranin. Kristal violet diberikan sebagai warna dasar sehingga lebih dahulu diikat oleh dinding sel, kemudian dilunturkan dan diberi pewarna safranin sebagai penutup. Bakteri yang dapat melepaskan ikatan zat warna dasar ketika dilunturkan dengan alkohol asam akan meningkatkan zat warna penutup safranin. Maka bakteri yang mengikat zat wana kristal violet akan berwarna ungu dan disebut gram positif, sedangkan bakteri yang mengikat zat warna safranin akan berwarna merah dan disebut gram negatif.

b.      Pewarnaan tahan asam

            Pewarnaan tahan asam juga membagi bakteri menjadi dua golongan, yaitu bakteri tahan asam dan bakteri tidak tahan asam. Bakteri tahan asam memiliki dinding sel yang banyak mengandung lilin yang disebut asam mikolat yang menentukan sifat tahan asam dari bakteri tersebut. Bakteri tahan asam sukar diwarnai, tetapi apabila sudah mengikat bahan pewarna akan sukar untuk dilunturkan, walaupun dilunturkan dengan alkohol 96% yang dicampur dengan asam kuat. Oleh karena itu, bakteri tersebut dinamakan bakteri tahan asam.

3.      Pewarnaan khusus

                  Pewarna khusus ditunjukkan untuk melihat struktur-struktur tertentu dari bakteri misalnya kapsul, flagella, endospora, granula metakromatis dan sebagainya. Pewarna khusus tersebut dilakukan secara rutin dilaboratorium mikrobiologi.

a.       Pewarnaan spora

      Spora (endospora) dibentuk oleh bakteri bila lingkungan disekitarnya sangat jelek dan bila keadaan membaik kembali maka spora tadi akan berubah menjadi vegetatif. Endospora bukan merupakan alat reproduksi, melainkan alat untuk mempertahankan diri.

   Spora adalah struktur bakteri yang sulit untuk diwarnai tetapi bila telah berkaitan dengan bahan pewarna sulit dilepaskan. Pewarna spora dapat dikerjakan melalui beberapa cara, tetapi yang sering digunakan adalah pewarnaan spora menurut schaeffer fulton.

b.   Pewarnaan kapsul

      Untuk melihat kapsul, dapat dilakukan pewarnaan dengan cara anthony, hiss, dan muir atau dengan pewarnaan negatif (negatif staning) menggunakan tinta cina (indian ink).

c.    Pewarnaan flagella

                  Flagella adalah alat gerak bakteri yang tidak dimiliki oleh semua bakteri dan untuk melihat flagella tersebut dapat dilakukan pewarnaan cara gray, leifson, atau leifson yang dimodifikasi.

d.             Pewarnaan metakromasi

     Granula metakromatik dimiliki oleh Corynebacterium Diphteriae, dan sebenarnya merupakan cadangan makanan bagi bakteri. Granula tersebut dinamakan volutine granula. Granula metakromatik dapat diwarnai dengan pewarnaan metakromasi, misalnya pewarnaan cara neisser.

e.    Pewarnaan polikromasi

                  Pada pewarnaan ini, bahan pewarna yang digunakan untuk pewarnaan dicampur jadi satu atau dapat pula diberikan satu persatu. Bodies dari chalamydia trachomatis. Salah satu contoh pewarnaan polikromasi adalah pewarnaan giensa yang dapat digunakan untuk melihat inclusions bodies dari Chlamydia trachomatis. Contoh pewarnaan yang lain dari polikromasi adalah pewarnaan wright.

BAB III

METODE PERCOBAAN

A.    Alat dan bahan

1.      Alat yang digunakan

a.       Deck gelas

b.      Hand scoon

c.       Lampu spiritus

d.      Mikroskop

e.       Objek gelas

f.       Ose bulat dan ose lurus

g.      Pipet tetes

2.      Bahan yang digunakan

a.       Kristal violet

b.      Etanol 95%

c.       Amonium oksalat

d.      Aquadest

e.       Iodine kristal

f.       Potasium iodine

g.      Safranin

h.      Larutan NaCl 0,9%

i.        Suspensi bakteri

j.        Alkohol

k.      Minyak imersi

B.     Prosedur kerja

I. Cara membuat preparat ulas biakan cair

1.         Dibersihkan kaca objek dengan kapas alkohol

2.         Diberi kode sampel yang akan dibuat

3.         Dipindahkan dua mata ose suspensi bakteri ke bagian tengah kaca objek

4.         Diulaskan suspensi secara merata dipermukaan kaca objek

5.         Dibiarkan preparat mengering diudara

6.         Difiksasi di atas api dan dilakukan pewarnaan bakteri

II. Cara membuat preparat ulas biakan padat

1.      Dibersihkan kaca objek dengan kapas alkohol

2.      Diberi kode sampel yang akan dibuat

3.      Diteteskan 2 mata ose NaCl-fisiologi ke bagian tengah kaca objek

4.     Disentuhkan ose pada biakan bakteri kemudian campur dengan  NaCL-fisiologi sehingga merata. Diulaskan campuran ini di atas kaca objek

5.      Dibiarkan preparat mengering diudara

6.      Difiksasi di atas api dan dilakukan pewarnaan bakteri

A.    Pewarnaan gram

      Reagen yang digunakan dalam pewarnaan gram adalah :

a.     Crystal violet

Larutan A : kristal violet 20 gram dan etanol 95% 20 ml

Cara pembuatan ; kristal violet dilarutkan denga etanol 95 %

Larutan B : ammonium oksalat 0,8 gram aquadest 8 gram

Cara pembuatan ; ammonium oksalat dilarutkan dengan aquadest

Cara pembutan reagen adalah mencampurkan larutan A dan larutan B dan disimpan selama 24 jam sebelum digunakan

b.  Garam iodine atau lugol

Iodine kristal 1 gram dan potassium iodine 2 gram serta aquadest 300 ml

Cara pembuatan reagen adalah melarutkan potassium iodine dengan 10 ml air kemudian ditambahkan iodine kristal diaduk hingga larut. Ditambahkan sisa aquadest hingga volume

c.       Larutan safranin

Larutan stok : safranin 2,5 gram dan etanol 95 % 100 ml

Cara pembuatan ; safranin dilarutkan dalam etanol 95 % hingga larut

Cara pembuatan reagen memcampur larutan stok 10 ml dengan aquadest 90 ml

1. Prosedur kerja pewarnaan gram

1.1 Dibuat sediaan diatas kaca objek,dikeringkan pada suhu kamar dan     dipanaskan diatas nyala api 3-4 kali. Didinginkan

1.2  Diletakkan sediaan diatas rak pewarnaan

1.3 Bakteri pada kaca objek ditetesi pewarna kristal violet, lalu dibiarkan 1 menit agar zat warna dapat diserap oleh dinding sel bakteri, kemudian dibilas dengan air, hati-hati janga sampai bakteri terbilas dengan air pembilas

1.4 Bakteri pada kaca objek ditetesi solution lugoli, lalu dibiarkan 1 menit, kemudian dibilas dengan air, hati-hati jangan sampai bakteri terbilas dengan air pembilas

1.5 Dicuci dengan alkohol asam biarkan hingga warna violet menghilang,  segera cuci dengan air pembilas.

1.6 Bakteri pada kaca objek ditetesi pewarna safranin, lalu dibiarkan 1 menit agar zat warna dapat diserap oleh bakteri, kemudian dibilas dengan air.

1.7 Selanjutnya ditetesi dengan minyak imersi, diamati dibawa mikroskop (amati warna mikroba)

1.8  Catatan : bakteri gram positif berwarna ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah

2. Prosedur kerja Pewarnaan negatif

2.1  Disiapkan kaca objek  diberi kode sampel

 2.2  Diambil nigrosin atau tinta cina dengan sengkelit dan lekatkan diatas  kaca    

2.3  Dibuat suspensi bakteri dengan larutan NaCl 0,9 % 1 tetes

2.4  Dicampurkan suspensi bakteri dengan nigrosin

2.5  Kemudian tutup olesan dengan kaca penutup

2.6  Diamati dibawa mikroskop dengan pembesaran 40 X kemudian 100 X

       menggunakan minyak imersi

2.7     Hasil : kapsul akan tampak sebagai daerah jernih disekitar     mikroorganisme dengan latar belakang sediaan tampak gelap

3. Prosedur kerja Pewarnaan sederhana

3.1 Pewarnaan yang digunakan adalah metilen-biru

3.2 Metilen-biru, sebagai counter stain.

3.3 Metilen-biru dan aquadest 100 ml

3.4  Cara pembuatan metilen-biru dilarutkan dalam air. Dapat juga digunakan   metilen-biru menurut loffler

4. Prosedur kerja pewarnaan sederhana

4.1 Dibuat sediaan diatas kaca objek, dikeringkan pada suhu kamar dan  

       kemudian dipanaskan diatas nyala api 3-4 kali lalu didinginkan

4.2 Diletakkan sediaan diatas rak pewarnaan

4.3 Dituang larutan metile-biru hingga menutup sediaan. Didiamkan 1 menit

 4.5 Dilihat dibawa mikroskop dengan pembesaran 100 X, menggunakan                 

       minyak imersi

4.4 Dibuang larutan dengan larutan dengan mencuci hingga warna hilang,                  

kemudian dikeringkan

4.6  Hasil semua bakteri akan berwarna biru, bentuknya terlihat jelas

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A.    Hasil pengamatan

NO	Metode pewarnaan	Hasil pengamatan	Keterangan
1.	Pewarnaan gram		Bakteri di samping adalah bakteri Escrechia.coli. Setelah di amati di bawah mikroskop ternyata bakteri tersebut bersifat gram positif karena mengikat warna dari kristal violet yakni warna ungu. bentuk bakteri tersebut adalah streptococcus (bulat dan berantai).
2.	Pewarnaan sederhana		Bakteri di samping adalah bakteri stapilococcus aureus. Setelah diamati di bawah mikroskop ternyata bakteri tersebut berbentuk basil (batang). Jika dilihat tanpa mikroskop warna dari bakteri tersebut biru warna tersebut dari warna metilen-biru, namun setelah dilihat dengan mikroskop warna tersebut tidak nampak. Karena pewarnaan sederhana ini hanya menggunakan satu jenis pewarna saja.

B.     Pembahasan

                   Laporan praktikum mikrobiologi kali ini adalah pewarnaan dan pengamatan morfologi pada bakteri. Pewarnaan gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang dikerjakan dilaboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pewarnaan tertentu (pewarnaan gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram negatif, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau kristal violet.

     Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun mengakhiri sebuah pekerjaan dilaboratorium dengan menggunakan teknik aseptik. Alkohol 70% yang disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan meja, bahkan tanganpun sebelumnya harus dicuci dengan sabun terlebih dahulu. Hal tersebut berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan agar mendapatkan pengukuran yang akurat.

     Pada proses pewarnaan gram, harus gelas objek yang bersih. Pembersihan ini dilakukan supaya gelas objek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya menggunakan alkohol. Setelah dicuci kemudian diberi satu tetes aquadest pada permukaan gelas objek. Kultur bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca objek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas.

               Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca objek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.

               Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan kristal violet sebagai pembentukan warna dasar bagi bakteri dan didiamkan selama 1 menit. Setelah itu dilakukan pembilasan pada bakteri, dapat dilihat jelas bahwa setelah pemberian kristal violet bakteri tersebut mengikat zat berwarna ungu dari kristal violet tersebut. Kemudian ditetesi alkohol asam untuk melunturkan warna dari kristal violet, didiamkan selama 1 menit, kemudian dibilas. Warna yang tadinya ungu terang terlihat menjadi ungu muda. Setelah itu ditetesi solutio lugoli untuk memperekat bakteri dan memberi warna yang jelas. Setelah pembilasan ditambahkan lagi safranin sebagai warna penutup, guna melihat bakteri tersebut mengikat zat berwarna ungu ataupun merah. Untuk lebih jelasnya, bakteri tersebut diamati dengan mikroskop namun sebelumnya ditetesi dengan minyak imersi. Melalui mikroskop tersebut, akan terlihat jelas bakteri tersebut gram positif ataukah gram negatif. Dapat dilihat di tabel pengamatan.

               Perbedaan dasar antara bakteri positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Komplek zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikannya  tipis.

               Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, pelunturan warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka zat warna terhapus. Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri yang tahan asam, dan ini merupakan ciri khas dari suatu species.

               Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi (coccu, bacillus, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarnaan sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri yang hanya digunakan satu macam zat warna saja.

               Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromotofiknya bermuatan positif).

              Pada pewarnaan sederhana, bakteri diwarnai oleh reagen tunggal. Pewarnaan dasar dengan kromogen (zat warna) muatan positif disarankan selama asam nukleat bakteri dan komponen dinding sel membawa muatan negatif yang menyerap dengan kuat dan mengikat kation kromogen perlu diperhatikan lamanya waktu pewarnaan tergantung pada jenis pewarnaan yang digunakan. Misalnya metilen-biru berserap selama 2-3 menit, dengan demikian bakteri yang terdapat pada sampel akan menyerap zat warna yang diberikan. Pengecatan sederhana digunakan untuk memperlihatkan atau memperjelas kontras antara sel dan latar belakangnya sehingga dapat mempertajam bentuk dari sel-sel mikroba itu sendiri, dengan cara mewarnai sel-sel mikroba dengan zat khususnya warna kristal violet.

  

BAB V

PENUTUP

A.    Kesimpulan

            Berdasarkan hasil pengamatan pewarnaanbakteri Eschericiacoli bersifat gram positif karena mengikat warna dari kristal violet yaitu warna ungu. Sedangkan pada pengamatan pewarnaan sederhana bakteri stapilococcus aureus memiliki berbentuk basil dan tidak menghasilkan warna yang dilihat dibawah mikroskop pada perbesaran 100x10

B.     Saran

            Adapun sehubungan dengan praktikum ini, khususnya ditujukan bagi mahasiswa yaitu diharapkan bagi seluruh mahasiswa agar selama kegiatan praktikum ini berlangsung, mahasiswa harus menggunakan alat pelindung diri. Diharapkan pula bagi semua mahasiswa, bahwa selama kegiatan praktikum ini berlangsung, agar semua mahasiswa bersungguh-sungguh dalam melakukan praktikum.

DAFTAR PUSTAKA

Cappuccino, J,G, 1983,Microbiology A Laboratorium Manual, Addison-Wesley  

       Publishing Company ,New York.

Dwidjoseputro,1994, Mikrobiologi untuk Universitas, Ganesha Epect: Bandung.

Gozali, Amir,2009. Pewarnaan Gram.    

       Http://www.gozali.blogspot.com/gram/pewarnaan gram-prinsip.html.

Madigan, M,T, 2003,Brock Biology of Microorganisme, Pearson Education; inc.

       United.

Pakadang, S,R, 2016,Buku Penuntun Praktikum Mikrobiologi dan Parasitologi,

       Makassar; Poltekkes.

LAMPIRAN

LATIHAN SOAL

Pewarnaan bakteri bertujuan untuk membedakan jenis bakteri satu dengan bakteri lainnya berdasarkan bentuk morfologi dan struktur selnya. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna metilen-biruyang menyebabkan bakteri akan terlihat morfologi yang jelas sedangkan pewarnaan gram menggunakan pewarna dan reagen berturut-turut kristal violet, alkohol asam, solutio lugoli, dan larutan safranin. Dimana bakteri gram positif akan terlihat sebagai warna ungu,  sedangkan bakteri gram negatif terlihat sebagai warna merah. Pewarnaan negatif menggunakan pewarna safranin yang menunjukkan bentuk bakteri sebagai warna merah dengan latar belakang kaca objek yang berwarna hijau bening. Dengan pewarnaan bakteri akan tampak dengan bentuk-bentuk batang, coccus, koma, dan spiral.